伯森生技電子報 20196月號第5 無法看到畫面顯示?請點選這裡開啟網頁

Collagen 實驗技巧

膠原蛋白 (Collagen) 是一個廣泛存在卻又高度保守的蛋白質家族,其特徵為連續的甘胺酸 (Glycine)-X-Y 三聯體重複序列,從而形成三股螺旋結構。由於不同類型的膠原蛋白間具有高度相似的三股螺旋結構,使得建構某種膠原蛋白的專一性抗體較為困難且富有挑戰性。

為了使某一種膠原蛋白抗體具有專一性,生成抗體所用的免疫抗原必須仰賴於未變性的三維膠原蛋白表位,或者僅存在於該特定膠原蛋白中的短肽序列。研究者需要根據所使用的膠原蛋白抗體類型,謹慎適時地調整實驗方案才能獲取精確的實驗成果。在此提供您幾點實驗注意事項和技巧,幫助您從膠原蛋白抗體取得預期的結果。

使用辨識未變性三維膠原蛋白抗體的
實驗注意事項

如果您正在使用通過未變性三維表位而研發的膠原蛋白抗體,那麼在實驗過程中必須要小心避免膠原蛋白的變性。如果膠原蛋白變性或者使用了福馬林固定、石蠟包埋,抗體的反應性會降低。以下為您提供一些調整實驗方案時的考量方向與建議。

ELISA

  • 使用具有天然三維結構的膠原蛋白標準品
    由於膠原蛋白序列的高度相似性,只有三級結構才具有足夠的差異以區分不同類型的膠原蛋白。因此在採用辨識未變性三維膠原蛋白抗體時,使用具有天然三維結構的膠原蛋白標準品是必須的。
  • 推薦使用 Sandwich ELISA
    在採用辨識未變性三維膠原蛋白抗體時,推薦使用 Sandwich ELISA 方式,因為這種方式能保持天然膠原蛋白結構。不推薦使用間接 ELISA,因為這種方式是將膠原蛋白直接連接到 ELISA plate 上,可能會破壞膠原蛋白的天然結構,導致抗體難以辨識。

Western Blot

  • 注意 pH、溫度和濃度,防止膠原蛋白聚合
    膠原蛋白在酸性條件下可溶,在鹼性 pH 下膠原蛋白會聚合形成凝膠,因此酸性 pH 對膠原蛋白的穩定性和可溶性至關重要。此外,如果膠原蛋白濃度太高,也會導致凝膠的形成。而由於膠原蛋白比其他蛋白質更不穩定,實驗應在 <10℃ 下進行。
  • 最適化電泳條件
    > 在樣品中加入洗滌劑、還原劑和變性劑 (Chaotropic agents)。
    > 膠原蛋白 I、II、III 使用 6% acrylamide 凝膠。
    > 膠原蛋白 IV、V、VI 使用 10% acrylamide 凝膠。
    > 梯度凝膠可能更適合用於展示全長片段和更小的片段。
  • 推薦陽性和陰性對照:推薦使用天然膠原蛋白質標準品作為陽性和陰性對照。
  • 推薦抗體稀釋度:0.5-1 μg/ml。

IHC - 福馬林固定、石蠟包埋

  • 確定交聯程度,並選擇合適的抗原修復條件
    當膠原蛋白的三重螺旋排列形成纖絲進而形成纖維時,膠原蛋白中可能發生交聯。交聯程度將決定曝露表位所需的抗原修復條件。Picrosirius red (ab150681) 染劑可專一性地結合至纖維膠原蛋白 (I–V 型) 的 [Gly-X-Y]n 螺旋結構上,因此可用於確定膠原蛋白的交聯程度。若可能,應盡可能地減少嚴苛的抗原修復條件,避免破壞膠原蛋白的三級結構。我們推薦使用 Sodium citrate 緩衝液 (pH 6.0) 進行抗原修復,然而酵素切割方式也很常用。請始終按照抗體說明書上所列的推薦抗原修復方法。
  • 推薦抗體稀釋度:1:500-1:2000

使用辨識短肽序列膠原蛋白抗體的
實驗注意事項

如果您正在使用通過辨識短肽序列而研發的膠原蛋白抗體 (例如 ab138492),無需特別小心地保持膠原蛋白的三維結構。Abcam 所有的 RabMAb? 膠原蛋白抗體都是使用合成短肽免疫製成的,對目標膠原蛋白具有序列專一性。使用通過辨識短肽序列而研發的膠原蛋白抗體,能讓您以一般常規的 Western Blot、ELISA 或 IHC 實驗流程進行檢測,無需額外考慮調整實驗方案。

選擇合適的膠原蛋白抗體

膠原蛋白 結構 分布 序列專一性抗體 結構專一性抗體
I 纖維狀 廣泛 ab138492 ab34710
II 纖維狀 軟骨、玻璃體 ab188570 ab34712
III 纖維狀 皮膚、血管、腸 ab184993 ab7778
IV 網狀 基底膜 ab214417 ab6586
V 纖維狀 廣泛   ab7046
VI 網狀 廣泛 ab182744 ab6588
VII 錨定纖維 真皮、膀胱 ab223639 ab93350
VIII 網狀 廣泛 ab58776  
IX FACIT 軟骨、角膜、玻璃體   ab134568
X 網狀 軟骨 ab182563 ab58632
XI 纖維狀 軟骨、椎間盤 ab196613  
XV FACIT 基底膜 ab58717  
XVII MACIT 上皮細胞中的半胞橋小體 ab184996  

Figure 1 Formalin/PFA-fixed paraffin-embedded sections of human colon tissue staining Collagen I with unpurified ab138492 in IHC analysis. Figure 2 ab21286 staining Collagen I (red) in mouse colon tumor cells by ICC/IF. Figure 3 IF analysis of human articular chondrocytes, staining Collagen II with ab34712. Figure 4 IHC analysis of paraffin-embedded human liver tissue labeling Collagen VI with ab182744.

更多膠原蛋白實驗技巧說明,請見:https://www.abcam.com/protocols/collagen

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